Центральная научно-исследовательская лаборатория
ГОО ВПО "ДонНМУ им. М. Горького"

МЕТОД
определения  АКТИВНОСТИ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ в крови


Принцип метода.
Основан на способности фермента, тормозить автоокисление адреналина при рН 10,2. Экстинкция регистрируется при 480 нм. Ввиду нестабильности субстрата за 1 условную единицу активности фермента принимают такое количество СОД, которое необходимо для ингибирования начальной скорости автоокисления адреналина на 50 %.
Реактивы:
1. Этанол.
2. Хлороформ.
3. 5 мМ трис-буферный раствор, рН 7,4.
4. 2,25х10-3 М водный раствор адреналина, готовится в день опыта, перед постановкой реакции прогревают 1 час при 37о С.
5. 0,15 М раствор Na2CO3, содержащий 3х10-4 М ЭДТА, рН 10,2.
6. 0,005 М раствор KH2PO4 (или К2НРО4) содержащий 1 х 10-5 М ЭДТА, рН 7,8.
Ход определения.
Для анализа отбирают 0,1 мл крови из пальца и разводят 5 мМ трис буферным раствором, рН 7,4 в соотношении 1:9. Из полученного гемолиза осаждают гемоглобин путем добавления 0,25 мл этанола и 0,15 мл хлороформа. Смесь охлаждают до -300С. После замораживания гемолизат тщательно перемешивают и затем центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 15 мин. для удаления гемоглобина и хлороформа. Прозрачный супернатант используют для определения активности супероксиддисмутазы.
Для измерения активности супероксиддисмутазы в кювету спектрофотометра вносят компоненты в следующей последовательности: 1) 1 мл 0,15 М раствор натрий-карбонатного буфера с добавлением 3х10-4 М ЭДТА, рН 10,2; 2) 0,5 мл супернатанта исследуемой крови (или воды, если измеряется контрольная проба); 3) 0,7 мл 0,005 М раствор калий-фосфатного буфера с добавлением 1х10-5 М ЭДТА, рН 7,8; 4) 0,4 мл 2,25х10-3 М водного раствора адреналина, рН 2,5.
Реакцию начинают добавлением адреналина и быстрым перемешиванием содержимого кюветы. Изменение активности супероксиддисмутазы проводят в кювете вместимостью 3 мл на спектрофотометре при длине волны 480 нм.
Сначала записывают начальную скорость свободного, не ингибированого автоокислителя адреналина в адренохром (контрольная проба). Затем определяют начальную скорость автоокисления адреналина в присутствии супероксиддисмутазы исследуемых проб, при этом исследуемый супернатант крови перед внесением в кювету необходимо разводить в 2,5 раза или 10 раз 0,005 М раствором калий-фосфатным буфером рН 7,8. Время реакции – 1 минута.
 Активность СОД (в Е/мг белка в крови) определяется по формуле:

((А – Е/А) х 100 : (100 – (А-Е) х 100/А)) х (2хN) / С,

где:
А – скорость автоокисления контрольного раствора адреналина (контрольная проба);
Е – скорость окисления адреналина в присутствии СОД (опытная проба);
N – разведение (N = 2,5);
С – концентрация белка цельной крови.
Норма: 0,05 – 0,15 Е/г белка
Воспроизводимость:  ±5 %
Источник: Макаревич О. П., Голиков П.П. Активность супероксиддисмутазы крови в острый период различных заболеваний//Лаб. дело.  - 1983.  - N 6. - C. 24-27